Оригинал - Seven of the epithelial cell cultures from each of the two culture techniques (from a total of 50 and 19 respectively from direct explant and enzymatic methods), which were at the first passages, were randomly selected for flow cytometry analysis for cell expression of vimentin, as the marker of mesenchymal cells, and cytokeratin, as the marker for epithelial cells. Cells were trypsinized with 0.0025% trypsin in Ethylenediamine tetracetic acid (EDTA). A cell count was performed and adjusted to approximately 5 х 10 cells in each of two Eppendorf tubes, one as the sample tube and the other for negative or isotype control. After removing the enzyme by centrifuging at 400 x g at 4 C for 10 min, cells in each tube were fixed and permeabilized with 1 ml of 70% ice-cold ethanol and stored for 5 min at 4 C. The cell liquid was then centrifuged at 400 x g at 4 C for 10 min and the supernatant was withdrawn. The cell sample in the sample tube was then stained with 25 μл 1:1000 of Cy3 conjugated monoclonal (mouse IgG1 isotype) anti-vimentin antibody (Sigma, St. Louis, MO, USA) and 25 μл 1:500 of fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated monoclonal (mouse IgG1 isotype) anti-pan cytokeratin antibody (Sigma, St. Louis, MO, USA), which recognizes human cytokeratins 4, 5, 6, 8, 10, 13 and 18. The mixture of cells and antibodies was incubated for 45 min at 4 C. The mixture was then washed twice with 1ml of 0.1% Bovine serum albumin in phosphate buffer saline (BSA-PBS), pH 7.3, and the liquid part was removed with centrifugation at 400 x g at 4 C for 10 min. The cell sample then had 450 μл of 2% formaldehyde in BSA-PBS added and was immediately stored in the dark at 4 C before analysis. For the negative or isotype control tube, the cell sample had 25 μл 1:1000 of mouse IgG1 isotype added (Pharmingen, Becton Dickenson, San Diego, CA, USa) and was incubated for 45 min at 4 C. It was then washed twice with BSA-PBS and 25 μл 1:500 of Cy3-goat antimouse antibody (Zymed Laboratort Inc., San Francisco, CA, USA) and 25 μл 1:500 of FITC-goat antimouse antibody (Zymed Laboratory INc., San Francisco, CA, USA) were added. It was then washed twice and 450 μл of 2% formaldehyde in BSA-PBS was added before storing in the dark at 4 C prior ro analysis. In addition to using isotype control as a negative control, positive control was also performed using the KB cell line, which were cells derived from an epidermoid carcinoma in the mouth of an adult male and had epithelial-like morphology (May et al., 1988). The KB cells were manipulated in the same way as a sample for flow cytometry.

Перевод - Семь культур клеток эпителия из двух методов культивации (общее число 50 и 19 соответственно, в результате метода культивирования в искусственой среде и ферментного метода), которые уже были описаны раньше, были выбраны в случайном порядке для проведения проточной цитометрии на присутствие в клетках виментина, как маркер для мезенхимных клеток и цитокератина, как маркера для клеток эпителия. Клетки были обработаны 0.025% трипсином в этилендиаминтетраацетате (EDTA). Был проведен подсчет количества клеток, а затем их расположили, приблизительно в соотношении 5 х 10 клеток в каждую из двух пробирок Eppendorf. Одна выступала в роли образца, а другая для отрицательного и изотипического контроля. После того, как был удален энзим с помощью центрифуги в течение 10 минут, при комнатной температуре 4 С и скорости 400 х g, клетки в каждой пробирке были зафиксированы, их сделали проницаемыми с помощью 1 мл 70% ледяного этанола и оставили на 5 минут при температуре в 4 С. Затем клеточная жидкость была центрифугирована на скорости 400 х g при температуре 4 С в течение 10 минут и таким образом отделили супернатант. Затем клеточные образцы в первой пробирке пометили с помощью 25 μл конъюгата Cy3 (мышиного IgG1 изотипа) анти-виментинового антитела в соотношении 1:1000 (Sigma, St. Louis, MO, USA) и 25 μл меченого FITC моноклонального (мышиного IgG1 изотипа) анти-пан цитокератинового антитела (Sigma, St. Loius, MO, USA) в соотношении 1:500, которое распознает цитокератин 4, 5, 6, 8, 10, 13 и 18. Смесь клеток и антител была инкубирована на 45 минут при температуре в 4 С. Затем ее дважды промыли в 1мл 0.1% альбумина бычьей сыворотки в фосфатно-буферном растворе (АБС-ФБР), pH 7.3, а затем жидкая часть была удалена с помощью центрифуги на скорости 400 х g при температуре 4 С, в течение 10 минут. Затем к клеточным образцам добавили 450 μл 2% формальдегида в АБС-ФБР и все сразу же поместили в темное помещение при температуре 4 С перед проведением анализа. Во вторую пробирку для отрицательного и изотипического контроля добавили 25 μл мышиного IgG1 изотипа (Pharmingen, Becton Dickenson, San Diego, Ca, USA) в соотношении 1:1000 и подвергли инкубации в течение 45 минут при температуре в 4 С. Затем все дважды промыли с помощью АБС-ФБР и добавили 25 μл конъюгата Cy3 с козьими антителами к изотипу антимыши (Zymed Laboratory Inc, San Francisco, CA, USA) в соотношении 1:1500 и 25 μл FITC-козьих антител к изотипу антимыши (Zymed Laboratory Inc, San Francisco, CA, USA) в соотношении 1:500. Затем все два раза промыли и добавили 450 мл 2% формальдегида в АБС-ФБР перед тем как поместить в темное помещение при температуре в 4 С перед проведеним анализа. Кроме изотипического контроля, был проведен и положительный контроль, используя клетки линии КВ, которые были получены из образца эпидермоидного рака во рту взрослого мужчины и имели схожую с эпителием морфологию (May et. al., 1988). С клетками линии КВ проделали ту же процедуру, что и с образцами во время проточной цитометрии.

Заранее огромное спасибо