DictionaryForumContacts

 ochernen

link 9.01.2011 18:59 
Subject: Focused Peptide Mapping
Исследование характеристик лекарственного вещества
В оглавлении пункт:
Focused Peptide Mapping with LC-MS for Deamidation Determination

Сам абзац к которому этот пункт относится не прояснил значения слова Focused.....
Мой вариант:
Целенаправленное пептидное картирование с жидкостной хроматографией-масс-спектрометрией для определения деамидирования
Если кто сталкивался, может есть устоявшийся термин??
Заранее благодарен

 ochernen

link 9.01.2011 21:43 
Еще вопрос что такое за пептидные карты:
Non-reduced and reduced peptide maps
Карты созданные в условиях восстановления и в невосстанавливающих условиях...
Помогите кто может и по предыдущему вопросу также.

 OlgaAvdeeva

link 10.01.2011 9:01 
Полагаю, что в Вашем случае пептидное картирование представляет собой двумерный электрофорез с изоэлектрофокусированием, как здесь, например:
http://ru-patent.info/21/20-24/2124024.html
Для разделения используют градиент рН, создаваемый с помощью амфолитов. Напряжение прикладывают сначала в одном направлении, а потом в перпендикулярном, получается двумерная картинка. Вот здесь описана техника эксперимента:
http://195.178.207.228/work/FILES/19/2D-PAGE.pdf
Термины "восстанавливающие" и "невосстанавливающие условия" широко используются в контексте электрофоретического разделения белков. Имеются в виду условия, восстанавливающие дисульфидные мостики, и условия, препятствующие их образованию. При этом молекула протеина имеет разную пространственную структуру.

 ochernen

link 10.01.2011 9:37 
Да нет там о электрофорезе и изоэлектрическом фокусировании речи нет. Абзац с объяснением принципа метода очень большой не могу привести.
Буду думать далее.
Спасибо!!

 OlgaAvdeeva

link 10.01.2011 10:04 
А что, Вы думаете, там пептидную карту на бумаге делают? Мне кажется, отбирают из геля фракцию с определенным значением рI и дальше проводят анализ ЖХ-МС, получая хроматограммы, подтверждающие присутствие деамидированных остатков.
Конечно, перед Вами весь текст, так что Вам виднее. А то я много чего придумать могу))

 ochernen

link 10.01.2011 10:14 
To OlgaAvdeeva Огромное и настоящее Спасибо. Извините если я что не так сформулировал, Ваша помощь для меня действительно очень ценна и..ну не специалист я в этом вопросе. просто пытаюсь разобраться по инструкции, а в инструкции ничего ИМЕННО МНЕ непонятно...
Я рискну привести весь абзац:
3.2.S.3.1.5.13 Focused Peptide Mapping with LC-MS for Deamidation
Determination (SOP DET-3189)
A tryptic peptide mapping method coupled with MS detection is used to determine the deamidation levels in belimumab samples. This method is used to quantitatively measure deamidation at peptide T4(H), which has been found to be the primary deamidation site for belimumab. The method is also used to monitor deamidation of peptides T25(H) and T36(H) that have been found to be susceptible sites of deamidation under stress conditions.

Principle
Belimumab is rapidly denatured, reduced and digested with trypsin, and then acidified with formic acid. The tryptic peptides are separated by RP-HPLC and detected by MS. The deamidation percentage of the peptide of interest is calculated from the peak area of extracted ion chromatogram (EIC) of deamidated peptide and that of its corresponding non-deamidated peptide.

Sampling
A reference standard is injected at the beginning and end of each sample set. Samples are injected once each for comparison to the reference standard.
Equipment and Equipment Parameters
The following equipment is used for the quantitation of deamidation in belimumab:
• Agilent 1200 HPLC system with Diode Array Detector (DAD).
• Agilent 6220 Accurate Mass Time of Flight (TOF) mass spectrometer.
• Agilent Zorbax 300 SB C18 (2.0 x 250 mm, 5 μm).
• Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis Software.
Tryptic peptides are separated by reversed-phase HPLC using an Agilent Zorbax 300 SB C18 column with an Agilent 1200 HPLC system. The column is heated to a temperature of 40°C and a flow rate of 0.3 mL/min is used. A gradient is used for peptide elution with the following parameters: 16% B for 5 minutes, 16 to 36% B from 5 to 65 minutes. The column is washed with 80% B for 10 minutes and then equilibrated at starting conditions for 20 minutes
before the next injection. Mobile phase A consists of 10 mM ammonium formate in Milli-Q water and mobile phase B consists of HPLC grade acetonitrile. The HPLC elution is monitored by UV detection at 214 nm. Four percent formic acid is infused continuously with a flow rate of 0.1 mL/min through a post-column splitter, leading to a final concentration of 1% formic acid prior to the mass spectrometer. The HPLC elution is directly delivered into
the TOF mass spectrometer with electrospray ionization for mass detection. The mass spectrometer is calibrated with an Agilent tuning mixture prior to each analysis. Both centroid and profile data are acquired in a 2 GHz mode with a mass range of 300-3000 (m/z). Ion source conditions are as follows: 9 mL/min drying gas flow rate, 45 psi for nebulizer, 350°C gas temperature, 2500 V capillary voltage and 175 V fragmentor voltage. Mass spectrometry
data are processed using Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis Software.

Еще раз огромное Вам спасибо, ой нет СПАСИБО!!
С уважением, ochernen

 OlgaAvdeeva

link 10.01.2011 10:36 
Да, действительно, мы привыкли называть пептидным картированием другие методики. Наверное, можно и эту методику так назвать, поскольку она предназначена для определения аминокислотной последовательности, да и пробоподготовка похожая.
Название инструкции можно перевести, как Вы написали в первом посте. Как говорится, за что купили, за то и продаем.
Если есть вопросы по приведенной здесь методике ЖХ-МС, пишите на почту, или задавайте вопросы в этой ветке, тема мне хорошо знакома.

 OlgaAvdeeva

link 10.01.2011 10:51 
Белимумаб расщепляют с помощью трипсина, а затем разделяют полученные куски на ЖХ, оснащенном диодно-матричным детектором и соединенном с масс-спектрометром (по существу это второй, масс-спектрометрический детектор, присоединенный к хроматографу). О степени деамидирования исходного белка судят по площади пика деамидированного остатка.

 ochernen

link 10.01.2011 11:01 
ОК! Спасибо.

 

You need to be logged in to post in the forum